不溶性微粒應(yīng)用專題 | 有色樣品的不溶性微粒測(cè)試

摘要：為探究有色樣品的顏色對(duì)光阻法檢測(cè)不溶性微粒是否存在影響，本實(shí)驗(yàn)以深紅色血液制品為對(duì)象，加入標(biāo)粒之后檢測(cè)，觀察標(biāo)粒粒徑是否偏移；本實(shí)驗(yàn)采用了美國(guó)Accusizer A2000 USP不溶性微粒檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力表明，該設(shè)備在檢測(cè)紅色樣品時(shí)抗干擾能力強(qiáng)，可以提供可靠的不溶性微粒檢測(cè)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：不溶性微粒；光阻法；有色樣品；血液樣品；檢測(cè)干擾

不溶性微粒（Sub-visible Particle），為不溶于水和有機(jī)溶劑、非代謝的、肉眼所看不見(jiàn)的顆粒物，通常指粒徑＜50μm的微粒。注射劑中的不溶性微粒主要來(lái)源為生產(chǎn)過(guò)程中各類(lèi)包裝容器黏附的各種微粒、生產(chǎn)原料以及生產(chǎn)工藝操作中產(chǎn)生的不溶性微粒，進(jìn)入人體可能引起各種不良反應(yīng)。

光阻法（LO/LE，Light obscuration/Light Extinction），又稱光遮蔽法、光消減法，其基本原理是使樣品液流經(jīng)一個(gè)狹窄的流通池，激光束穿過(guò)流通池并被光電探測(cè)器接收，當(dāng)溶液中的顆粒通過(guò)光束時(shí)，會(huì)遮擋部分光線，引起光強(qiáng)變化，該變化與顆粒的投影面積成正比，通過(guò)信號(hào)處理可換算為顆粒的粒徑與數(shù)量。

由于光阻法檢測(cè)速度快、定量精準(zhǔn)度高、重復(fù)性佳，且能同時(shí)測(cè)定微粒大小和數(shù)量，適用于大范圍粒徑區(qū)間微粒分析，在現(xiàn)行的中國(guó)藥典通則 <0903> 不溶性微粒檢查法和美國(guó)藥典 < 788 > 中，均將光阻法列為方法學(xué)，光阻法是制藥行業(yè)及相關(guān)領(lǐng)域不溶性微粒控制的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

不過(guò)，基于光阻法的光學(xué)方法學(xué)特性，且目前市場(chǎng)上主流光阻法儀器多采用波長(zhǎng)約 630-650nm 的紅色激光作為光源，一個(gè)值得探討的問(wèn)題是：其檢測(cè)結(jié)果是否會(huì)受到樣品本身物理特性的干擾，尤其是樣品的顏色，會(huì)不會(huì)成為關(guān)鍵影響因素？對(duì)于紅色樣品（如含鐵制劑）而言，會(huì)不會(huì)因自身顏色干擾檢測(cè)過(guò)程，使得測(cè)試結(jié)果變得不可靠？

因此，面對(duì)這類(lèi)有色樣品時(shí)，光阻法設(shè)備是否能夠準(zhǔn)確測(cè)試出顆粒的粒徑和濃度結(jié)果，就成為了需要重點(diǎn)考量的問(wèn)題。

為考察顏色對(duì)光阻法檢測(cè)的影響，我們以某血液制品為樣本，該樣品呈紅色，使用AccuSizer A2000 USP不溶性微粒檢測(cè)儀進(jìn)行不溶性微粒測(cè)試。

圖1 樣品原液、5倍稀釋、10倍稀釋

如圖1所示，樣品原液、5倍稀釋樣品、10倍稀釋樣品均呈現(xiàn)為不透明的深紅色，其中樣品原液接近黑色，隨著稀釋倍數(shù)的遞增其顏色深度呈梯度減淡，但仍然保持深紅色的基本顏色特征。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，使用添加標(biāo)粒的方式進(jìn)行對(duì)照測(cè)試以評(píng)估原液顏色對(duì)于測(cè)試結(jié)果的影響。

將24μm標(biāo)準(zhǔn)粒子加入純化水中，測(cè)試其平均粒徑，作為對(duì)照組，將24μm標(biāo)準(zhǔn)粒子加入不同梯度稀釋倍數(shù)的樣品中，測(cè)試其平均粒徑，探究顏色對(duì)標(biāo)粒粒徑結(jié)果是否有影響。

圖2 水+24μm標(biāo)粒測(cè)試結(jié)果譜圖

圖3 樣品原液+24μm標(biāo)粒測(cè)試結(jié)果譜圖

圖4 五倍稀釋樣品+24μm標(biāo)粒測(cè)試結(jié)果譜圖

圖5 十倍稀釋樣品+24μm標(biāo)粒測(cè)試結(jié)果譜圖

將24μm標(biāo)粒添加到純化水中，平均粒徑為23.971μm，然后將24μm標(biāo)粒添加到樣品原液中制得樣1，進(jìn)行檢測(cè)，平均粒徑為23.734μm，濃度2225顆/mL，將樣1稀釋5倍，測(cè)試的平均粒徑為23.734μm，濃度537顆/mL；再將樣1稀釋10倍，平均粒徑為23.951μm，濃度254顆/mL。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，相比加入純水中的標(biāo)粒結(jié)果，原液添加標(biāo)粒的檢測(cè)結(jié)果存在輕微粒徑偏移，但隨著稀釋倍數(shù)的增加，該偏移現(xiàn)象減弱，說(shuō)明樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾有限。盡管原液為深紅色，其光學(xué)特性未對(duì)粒徑識(shí)別與計(jì)數(shù)造成顯著影響，證明該樣品直接進(jìn)行該顏色狀態(tài)下的不溶性微粒檢測(cè)，顏色因素未導(dǎo)致明顯系統(tǒng)誤差。

此外，報(bào)告中還進(jìn)行了儀器狀態(tài)驗(yàn)證，使用美國(guó)MML公司提供的0.8、2、5μm混合標(biāo)準(zhǔn)顆粒進(jìn)行校準(zhǔn)，確保檢測(cè)系統(tǒng)在粒徑識(shí)別與計(jì)數(shù)方面的準(zhǔn)確性。在設(shè)定檢測(cè)下限為5μm的前提下，不同閾值下的測(cè)試結(jié)果重復(fù)性良好，進(jìn)一步支持了該方法在有色樣品中的適用性。

綜上，通過(guò)實(shí)際測(cè)試案例可知，盡管光阻法在理論上可能受到樣品顏色的干擾，但AccuSizer A2000 USP不溶性微粒檢測(cè)儀在檢測(cè)紅色血液制品時(shí)，仍能保持高準(zhǔn)確性與重復(fù)性。該儀器具備抗顏色干擾能力，能夠?yàn)橛猩珮悠啡绾F制劑、血液衍生物等提供可靠的不溶性微粒數(shù)據(jù)。

圖6  AccuSizer A2000 USP不溶性微粒檢測(cè)儀

AccuSizer A2000 USP不溶性微粒檢測(cè)儀是Entegris（PSS）旗下的專業(yè)檢測(cè)設(shè)備，采用單顆粒光學(xué)傳感計(jì)數(shù)（SPOS）技術(shù)，融合光阻效應(yīng)與光散理論，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)。設(shè)備檢測(cè)范圍覆蓋 0.5-400μm，有1024數(shù)據(jù)通道與32自定義通道，兼具 0.01μm 超高分辨率和10PPT級(jí)超高靈敏度，最小進(jìn)樣量低至50μL，微量進(jìn)樣仍保持高準(zhǔn)確性。

設(shè)備采用模塊化設(shè)計(jì)，支持自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)稀釋等功能拓展，軟件符合 FDA 21 CFR Part11 及cGMP規(guī)范，符合ChP、USP、JP 等多國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)與法規(guī)報(bào)告，可滿足研發(fā)、質(zhì)控全流程需求。